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        了解PCR反應中Taq酶的使用

        來源: 上海邦景實業有限公司 >> 進入該公司展臺 2022/05/16 15:47:58 已瀏覽:
        導讀:了解PCR反應中Taq酶的使用

        PCR使用的Taq酶應該注意如下問題

        為彌補taq酶這一缺點常將克隆后的序列進行測序,來確認擴增序列的準確性。同時也可采用保真度更高的Pfu DNAPolymerase,來確保擴增的準確性,Pfu DNAPolymerase有3 ’-5’的外切酶活性,5’-3’外切酶活性,是目前已發現的有耐高溫DNA 聚合酶中出錯率Z低的。但PCR產物為平端,不能進行Ta克??!而解決此問題的辦法是使用TaqPlus DNAPolymerase,該酶是Taq 酶和pfu Polymerase的混合物,因此既能保證準確性又能保證能夠進行Ta克隆。在使用中應該注意如下問題:


        1.25ul體系中一般用量為0.1ul(用槍頭沾一下即可),用量過多可能會出現非特異性擴增。


        2.PCR體系構建過程中Z后加入的一種成分,因此只有在其他試劑加完之后才可從冰箱中取出加入。


        3.Taq酶中含有甘油,故不結冰,若結冰則應丟棄。


        4.對于預變性時間較長的PCR反應,應在預變性即將結束后加入酶,減少長時間高溫對酶活力造成的損傷。


        5.保存時間過長的酶可以適當增加用量。


        PCR使用的taq酶在反應時由于喪失3’——>5’外切核酸酶活性,因而不具有校正活性。在典型的一次PCR反應中,taq酶造成的錯誤的核苷酸錯誤的摻入率大概為每20000個核苷酸中就有一個,雖然表面上看起來不會有多大的影響,但是在分子克隆中如果有一個錯誤核苷酸摻入,很有可能造成移碼突變,影響是嚴重的

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